+
Stratégies pour la production rapide de protéines thérapeutiques dans les cellules de mammifères On estime que des centaines de nouvelles protéines recombinantes et d'anticorps monoclonaux (mAb) entrent dans le développement préclinique et clinique chaque année (1. 2). la concurrence mondiale concomitante dans la fabrication de produits biologiques a mis une énorme pression pour raccourcir le temps de marché. Au fil des années, des cellules de diverses origines ont été utilisés pour la production de protéines thérapeutiques (2. 3, 5). L'un des choix les plus économiques, est Escherichia coli, utilisé pour fabriquer des protéines telles que l'insuline humaine et l'hormone de croissance. Mais les bactéries ont des lacunes graves, comme une incapacité à effectuer des modifications post-traductionnelles des protéines (6). des lignées de cellules de mammifères telles que des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), les reins (BHK) bébé hamster ou des cellules de fibrosarcome humain ont porté sur la glycosylation nécessaire dans la production de certaines protéines thérapeutiques (6). Pour les anticorps monoclonaux, les lignées cellulaires CHO et NS0 sont des hôtes d'expression les plus couramment utilisés (2. 4). FOCUS PRODUIT: ANTICORPS ET AUTRES PROTÉINES DE MAMMIFÈRE CELLULES PROCESSUS FOCUS: PRODUCTION QUI DEVRAIT LIRE: LIGNE CELLULAIRE ET DEVELOPPEMENT PROCESS MOTS CLES: CELLULES CHO, SERUM-FREE MEDIA, DHFR, TRANSFECTION TRANSITOIRE, JETABLES, CELL LINE ENGINEERING, MTX, AUTOMATION, CELLULE TRIAGE NIVEAU: BASE POUR INTERMEDIAIRE Figure 1: coloration d'anticorps d'une protéine cible membranaire (vert) et la coloration des noyaux avec DRAQ5 (rouge). () Habituellement, pour l'expression de mammifère, des clones stables avec des productivités spécifiques élevées sont le point de départ pour amorcer le développement d'un biothérapeutique commercial. Cette première étape prend plusieurs mois et peut constituer un obstacle majeur pour atteindre le marché. Depuis le début des années 1980, les progrès dans le développement des médias, des stratégies de sélection pour identifier les clones très productifs, et des stratégies d'alimentation en éléments nutritifs ont permis d'obtenir des titres d'expression de 15 g / L dans les bioprocédés actuels (7). La figure 1 montre les étapes critiques d'une plate-forme de production en amont qui se rapportent à la réussite d'un produit thérapeutique. Avec la plate-forme de production alternative à grande échelle de transfection transitoire, milligramme à gram quantités de matériaux représentatifs peuvent être produits. Cela le rend très attrayant pour l'identification de plomb, l'initiation des études précliniques, le développement d'essais biologiques, le développement de la formulation, et la purification. Au moment où un clone solide peut être généré et caractérisé par les dosages nécessaires pour traiter le matériel commercial seraient développés. Ici, nous discutons des stratégies qui ont considérablement réduit les lignes de développement biothérapeutique temps: vecteurs d'expression, le dépistage du clone, et des méthodes d'isolement clonales, ainsi que des plates-formes alternatives de production pour générer rapidement milligramme du gramme quantités de protéines. Milieux chimiquement définis milieux de culture cellulaire pour les cellules de mammifères ont fait des progrès considérables depuis le développement de l'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), qui a été le premier agent biologique approuvé par la FDA exprimée par des cellules CHO (8). A l'origine, 220% de sérum était standard pour la croissance de cellules adhérentes in vitro. Mais les cultures de cellules de suspension qui pourrait être mis à l'échelle rapidement jusqu'à sont préférés pour la production à grande échelle. Se substituer à du sérum dans ces cultures, les entreprises d'abord utilisé des protéines telles que l'albumine, la transferrine et l'insuline (9). Mais les préoccupations réglementaires plus un risque élevé d'agents fortuits dirigés développeurs de médias vers des produits sans sérum. médias sans sérum définis chimiquement (SFM) supports spécifiques sont fabriquées commercialement pour une performance supérieure (tableau 1). Tableau 1: lignées cellulaires Industriellement pertinentes adaptées à la production rapide de protéines thérapeutiques recombinantes dans un milieu sans sérum (liste non exhaustive) Tableau 1: lignées cellulaires Industriellement pertinentes adaptées à la production rapide de protéines thérapeutiques recombinantes dans un milieu sans sérum (liste non exhaustive) () Presque toutes les manipulations de la culture lors de la génération cellulaire en ligne sont maintenant optimisés pour des conditions sans sérum (12). Parfois, les cellules en croissance en suspension peuvent agréger ou bouquet. Addition de sulfate de dextran ou des agents antimottants disponibles dans le commerce pour les milieux de culture dans une proportion optimale peut résoudre ce problème. Mais ces additifs (ainsi que d'autres composants du milieu) sont connus pour interférer avec la délivrance d'ADN efficace dans les cellules hôtes. La disponibilité commerciale des sans sérum et chimiquement définis pour les lignées cellulaires largement utilisés (par exemple CHO, NS0, BHK, HEK293) permet désormais aux chercheurs d'établir facilement leurs plates-formes de culture cellulaire. défini Chimiquement, animal-componentfree (CDACF) médias de minimiser les variations de lot et ont simplifié le traitement en aval en incorporant moins de contaminants, ce qui contribue à la conformité réglementaire. Moderne, disponible dans le commerce SFM la productivité des cellules boost de nombreuses fois sur les médias contenant du sérum (12). Sur mesure pour des lignées cellulaires spécifiques, comme la production des médias de protéines de soutien plutôt que cellule génération de masse. Bien que les rendements> 20 g / L ont été rapportés, les lignées cellulaires sont e xpected pour produire au moins 1 g / L. Pour améliorer encore le rendement du produit, un processus fed-batch est généralement choisi, avec une supplémentation optimisée de l'alimentation en éléments nutritifs (13). Identifier le taux de chaque nutriments de la consommation en analysant les médias dépensés donne généralement une idée des besoins métaboliques spécifiques des cellules. Bien que les besoins nutritionnels de la culture de cellules de mammifères sont largement acceptés à cloner spécifiques, bioprocessors aimeraient les médias génériques qui pourraient être utilisés dans une large gamme de lignées cellulaires pour la production commerciale. Compte tenu des avantages de coût et de temps de tels milieux de culture de la plate-forme, les fournisseurs travaillent à leur développement. L'amplification DHFR: Dans la construction in vitro de l'ADN recombinant (ADNr) a ouvert la voie fonctionnelle pour l'expression de protéines étrangères dans des cellules hôtes (14). Après la production commerciale d'insuline en utilisant des bactéries, des vecteurs d'expression ont rapidement été conçus pour produire des protéines recombinantes en utilisant des cellules de mammifère (15). Dans les années 1950, la recherche de cellules cancéreuses de la résistance aux agents chimiothérapeutiques tels que le methotrexate (MTX) a conduit à la découverte de la dihydrofolate reductase (DHFR mécanismes), le gène d'amplification (16, 18). Qui forment la base d'origine de la production de protéines recombinantes dans des cellules CHO sans activité DHFR. Des cellules hôtes CHO déficientes en DHFR sont transfectées avec un vecteur d'expression contenant le gène de DHFR sous un faible promoteur de SV40 et le gène d'intérêt (pour l'expression d'un anticorps monoclonal ou une autre protéine recombinante) sous un promoteur fort de cytomegalovirus (CMV). Des concentrations croissantes du pas à pas MTX agent de sélection (de 50 nm à 5 niveaux de productivité spécifique. Une DHFR ADNc de souris modifiée qui diffère par un acide aminé a montré anormalement faible affinité au MTX (20). Cette variante a été utilisée comme marqueur de sélection dominant pour des cellules cultivées qui expriment des niveaux normaux de l'enzyme DHFR (20). Quelle que soit la variante DHFR, chaque étape d'amplification prend trois à quatre semaines de travail, ce qui en fait un processus gourmand en temps. Pour réduire au minimum les délais, augmenter en une seule étape à des niveaux de MTX très élevés peut produire quelques clones survivants qui expriment des niveaux élevés de DHFR. Malheureusement, ces développements peuvent conduire à des altercations indésirables dans la fonction DHFR (18). Néanmoins, les concentrations de MTX élémentaires en plusieurs étapes ont été optimisés pour obtenir des rendements beaucoup de produits de> 1 g / L rapidement (21. 22). Les avantages de DHFR vecteurs d'expression l'emportent sur leurs limites. Maintenant hors brevet, le système d'expression DHFR est encore utilisé pour produire des lignées cellulaires élevées exprimant en conjonction avec des éléments génétiques et l'amélioration des paramètres de développement de lignée cellulaire (23). En 2010, CMC Biologics (cmcbio) a montré que l'inclusion de nouveaux deoptimization de codon (moins pratique pour la traduction) des séquences DHFR dans ses vecteurs propriétaires ont augmenté leur rigueur de la sélection et prévue pour la production de protéines rapide (24). Le système d'expression de Invitrogens est basée sur des vecteurs d'expression de la DHFR. Le système GS: Un autre exemple bien connu de l'amplification génique est la glutamine synthétase (GS), le système d'expression (8. 9. 25. 26). SG est un marqueur dominant sélectionnable qui peut être utilisé avec des cellules GS-négatives NS0 (25. 27), ainsi que des cellules CHO qui contiennent un gène de GS endogène actif (26. 28). Ce dernier, cependant, nécessitent l'inhibiteur de l'enzyme méthionine sulfoximine GS (MSX). Environ 2010 copies du gène de GS dans NS0 et 200 copies dans des cellules CHO ont été observées lors de l'amplification (25). Dans certains cas, des productivités spécifiques élevés pourraient être atteints sans amplification. Coexpression de E1a, d'un transactivateur du promoteur du CMV, produit une augmentation des rendements de 10 fois (26). Étant donné que les lignées cellulaires dérivées GS ne nécessitent pas de complémentation de la glutamine externe, une très faible accumulation d'ammoniac toxique est observée dans ces systèmes. Jusqu'à présent, cinq médicaments approuvés par la FDA ont été commerTadalafilés en utilisant le système GS, y compris anticorps MedImmunes Zenapax. l'instabilité cellulaire en ligne pose toujours un défi pour le système d'expression GS, en particulier avec des clones CHO-dérivés après le retrait MSX (29). Modification du CHO GS profil endogène d'expression génique après le retrait MSX est considéré comme le principal facteur de cet effet. En Juillet 2011, Lonza a annoncé le développement de GS cellules CHO négatives en utilisant le gène de la nucléase de doigt de zinc assommer la technologie pour résoudre les problèmes de stabilité, tout en promettant rapide génération cellulaire en ligne. Autres systèmes: la productivité cellulaire en ligne dépend de l'activité transcriptionnelle sur le site de l'intégration du gène recombinant. Plusieurs éléments génétiques peuvent être inclus dans un vecteur d'expression pour des productivités spécifiques élevées à droite à l'étape de la piscine transfectées: régions de fixation échafaudage / matrice (S / MAR) à partir de Selexis (Selexis), des éléments d'ouverture de chromatine ubiqutous (UCOE) de Millipore (Millipore) et stabilisant et antirépresseur (STAR) de Crucell (Crucell). Evalué intensivement par Kwaks et Otte (30), ces éléments génétiques améliorent l'expression du transgène et clonale variabilité indépendamment du type de mammifère (31, 75 pg / cellule / jour. Un certain nombre de produits thérapeutiques sont développées en utilisant ces technologies expression vecteur nouveaux, et nous espérons voir leur approbation par la FDA dans un avenir proche. sites d'intégration du gène recombinant exigent non seulement les niveaux d'expression du transgène, mais également la stabilité génétique à long terme. De ce fait, diriger l'intégration dans l'expression exogène, favorisant génomique d'une lignée cellulaire hôte prévoit la production de protéine prévisibles (34). En outre, une seule copie du gène recombinant intégré à l'un des sites génomiques favorables peut exprimer des quantités de protéines qui sont comparables à des copies multiples dans des lignées cellulaires amplifiées (35. 36). Cela offre des avantages potentiels de la caractérisation et la mise en œuvre d'approches d'intégration spécifiques au site à l'industrie de la biotechnologie. Des efforts ont été faits dans ce sens par échange de recombinase à médiation par cassette (CREM) (37, 43). Cependant, les productivités spécifiques des lignées de cellules produites à ce jour ont été que modérée. sites d'intégration plus compatibles doivent être identifiés. Un clone stable avec une productivité élevée spécifique est une exigence non négociable pour la production commercialement viable de MAbs thérapeutiques. Identifier les producteurs élevés souhaitables dans une piscine transfectées de cellules constitue un goulot d'étranglement majeur dans le développement cellulaire en ligne, car une piscine transfectées est bondé avec de faibles producteurs et producteurs élevés sont rares. Repérer un clone de haute production est parfois décrite comme La méthode classique pour le criblage de clone et l'isolement utilise le dépistage de limitation de dilution dans laquelle environ une cellule unique par puits est déposée en microplaques. Un rapport prédéterminé de milieu conditionné est mélangé avec du milieu frais pour fournir de meilleures conditions de croissance pour chaque cellule unique de diviser. Cette technique manuelle est fastidieuse et inefficace. Avec un nombre limité de clones criblés, il y a toujours une possibilité de manquer le meilleur candidat. FACS Screening: De nombreuses méthodes de criblage à haut débit sont en cours d'élaboration afin de réduire le temps et augmenter l'efficacité de l'identification des producteurs élevés (44). L'amélioration de débit ont été réalisées en utilisant des procédés basés sur des cellules activé par fluorescence (FACS), qui est une technologie de flux de cytométrie de propriété de Becton Dickinson and Company (BDBiosciences) (45). En général, la productivité spécifique d'une cellule est estimée en se basant sur un signal fluorescent, et les clones désirés sont efficacement séparés de milliers de candidats dans un laps de temps très court. En 2003, Brezinsky et al. démontré l'efficacité du criblage à base de FACS pour enrichir rapidement des cellules à forte production par coloration des cellules transfectées avec des anticorps marqués fluorescents spécifiques à une protéine d'intérêt (46). Sans utiliser le MTX, l'équipe a augmenté la productivité de 25 fois; avec le MTX amplification, cette augmentation était> 120 fois. La corrélation positive des protéines d'expression de surface cellulaire avec la productivité spécifique d'un clone fourni un moyen simple et rapide pour développer des lignées cellulaires exprimant de haut (47). Mais la mise en œuvre de la méthode nécessite, des anticorps fluorescents marqués spécifiques au produit. Quelques groupes utilisent la protéine fluorescente verte (GFP) pour la sélectivité. GFP a été utilisé comme une deuxième unité de transcription (48) et fusionnée dans le cadre avec un marqueur sélectionnable metallotheonine, pour générer amplifiable MTGFP (49). Dans les deux cas, des productivités plus élevées ont été observées avec la méthode FACS à base de GFP avec la sélection traditionnelle. Une corrélation positive du signal de la GFP et le taux de production de protéines pour permettre la génération rapide de clones sans, des anticorps fluorescents marqués spécifiques au produit. Dans une étude, le CD20 de protéine de surface a été exprimée en tant que journaliste, et FACS tri a aidé rapidement et précisément générer la protéine d'intérêt (50). Non seulement n'a suivi l'expression de CD20 aider à identifier les producteurs élevés, mais que les niveaux CD20 diminuent au fil du temps, des clones instables peuvent être enlevés au cours des étapes de développement précoce. Bien que l'identification des clones désirés sur la base de la surveillance d'une autre protéine a amélioré l'efficacité de génération de lignes à forte production cellulaires, il a également placé une pression supplémentaire sur la synthèse des protéines cellulaires Dans une autre approche basée sur FACS, methotraxate marqué par fluorescence a été utilisé comme marqueur pour identifier les producteurs élevées ( 51). Cellules avec le signal le plus élevé de fluorescence (MTX), triées par FACS à l'aide ont un nombre élevé de copies DHFR, qui sont corrélés à des productivités élevées. Cette méthode a produit des cellules CHO amplifié avec des productivités spécifiques élevées dans les quelques semaines. Automatisation: systèmes automatisés tels que la machine ClonePix de Genetix (genetix) et le système Cell Celector de Aviso (aviso) effectuent criblage cellulaire à haut débit et clone isolement du produit-secretionbased. piscines transfectées sont enrichis sous pression sélective. Les transfectants positifs comme se remettre de cette pression, les cellules sont étalées à faible densité dans un milieu semi-solide supplémenté avec un anticorps étiqueté de manière fluorescente qui est spécifique au produit sécrété. Les clones positifs poussent comme des colonies individuelles et sont identifiés sur la base d'un halo fluorescent autour d'eux. L'intensité du signal fluorescent, et la taille de la colonie déterminent la sécrétion du produit et le taux de croissance clonale. L'utilisation d'un programme optimisé, les clones désirés sont prélevés et déposés sur des plaques à 96 puits en utilisant un bras robotisé. Les clones ainsi isolés ont été montré pour maintenir leur classement de productivité lors de l'expansion (52). Par conséquent, les producteurs élevés sont identifiés à la première étape du dépistage, ce qui raccourcit ensuite la chronologie globale de développement. Cependant, les caractéristiques de clones changent d'un hôte et un système d'expression à l'autre, de sorte que cloner les classements doivent être vérifiées dans des flacons agités. Et la plupart des méthodes de criblage à haut débit nécessitent des équipements coûteux. La production de produits au stade clinique par des lignées cellulaires stables est actuellement répandue, car il offre des rendements élevés, la qualité constante du produit, et la familiarité réglementaire. Cependant, milligramme à gram quantités de protéines sont souvent nécessaires dans le développement précoce. Parce stable génération cellulaire en ligne prend du temps et de ressources, la transfection transitoire dans des cellules de mammifères est fréquemment utilisé à ce stade à la place (5. 53). La procédure exige la formation d'polyplexes chargés positivement de l'ADN plasmidique surenroulé portant un gène d'intérêt dans un milieu approprié, puis on ajoute ensuite goutte à goutte à une croissance exponentielle des cellules de mammifères. Pham et al. examiné cinq aspects clés de la réalisation de transfection très efficace (5): lignée cellulaire, vecteur d'expression, le plasmide qualité de l'ADN, véhicule de transfection, et milieu de culture. A l'origine, les cellules HEK293 ont été l'hôte choisie pour l'expression transitoire du gène (TGE). Par comparaison, les cellules CHO sont plus difficiles pour la transfection transitoire, le plus souvent avec des rendements inférieurs (54, 56). La qualité des produits diffère entre les deux lignées de cellules (57), et CHO est l'hôte préféré pour la production de protéines commerciale, de sorte que la plupart des entreprises préfèrent utiliser la même plate-forme d'expression à travers leur travail de développement. Des efforts importants ont été investis sur l'amélioration de TGE dans les cellules CHO, et productivités allant de 10 mg / L à> 100 mg / L peut maintenant être atteint (5. 58). lignées cellulaires d'ingénierie et de suppléments alimentaires ont augmenté les rendements globaux des processus pour améliorer le potentiel existant de la technologie TGE. cellules Canadas CHO-S en utilisant le réactif de transfection Freestylemax sont également prometteurs (63). Cependant, le polyéthylènimine coût relativement faible (PEI) réactif est préférée pour la transfection transitoire à grande échelle. la qualité MAb obtenu à partir d'une transfection transitoire a été trouvé être le même que celui obtenu à partir de lignées de cellules CHO transfectées de façon stable (55. 58. 64). Mais les rendements des procédés variés par lots en fonction de divers facteurs pourraient être pris en considération, avec 200 millions ou plus de cellules par flacon. Piscines transfectées de façon stable La technologie de la piscine transfectées de façon stable gagne en popularité (65). Lucas et al. d'abord présenté l'utilité des pools stables à générer milligrammes de protéine recombinante rapidement en utilisant un vecteur d'expression DHFR DISTRONIC et la sélection MTX (66). Contrairement à grande échelle TGE, la transfection de piscines stables est réalisée à petite échelle, alors transfectants positifs sont enrichis pour une période de deux semaines avant de les étendre dans des milieux sélectifs. En utilisant des vecteurs d'expression de propriété, Selexis a généré une banque transfectée stable de 250 pools productrices d'IgG de cellules CHO (67). Le titre d'anticorps le plus élevé sur 10 jours d'un procédé fed-batch dépasse 1 g / L, ce qui démontre l'avantage de pools CHO stables transfectées pour produire de grandes quantités de protéines pour des études précliniques rapidement. pools stables sont extensible jusqu'à 200 L (68), générant des quantités en grammes de matière représentative, sans utiliser de grandes quantités d'ADN de plasmide. Une fois établies, les pools stables peuvent fournir de petites quantités de matériau à plusieurs reprises sans optimisation supplémentaire. Cependant, leurs productivités peuvent être augmentées par des tris cellulaires répétées et l'inclusion de - elements cis UCOE dans un vecteur d'expression (69). piscines stables peuvent être commodément cryoconservés, qui fournit un point d'arrêt facultatif dans un programme de développement. Quand ils sont nécessaires, les piscines cryoconservés stables peuvent être réactivés dans la culture et criblées pour les clones haute production stables. Ces piscines sont stables pour une période limitée, il est donc essentiel que les clones à forte production être isolés pendant cette fenêtre de temps. Jianxin vous et al. ont également montré que la qualité des produits de protéines produites par des groupements stables est similaire à celles exprimées par les lignées cellulaires clonales (68). Sachant que les baculovirus peuvent infecter des cellules de mammifères et d'exprimer un transgène cloné en fait l'une des méthodes les plus prometteuses pour la production de protéines recombinantes. Un baculovirus d'ingénierie contenant des éléments de transcription de mammifères actifs (Invitrogen avec sécurité intrinsèque, cytotoxicité négligeable, une plus grande taille d'insert, et facile à l'échelle. Ils ne sont pas pathogènes pour les cellules de mammifères, ce qui rend baculovirus un outil intéressant pour l'expression transitoire de protéines dans les cellules de mammifères. Des chercheurs de GlaxoSmithKline ont mis en œuvre la technologie BacMam dans des analyses pharmacologiquement pertinentes pour la découverte de médicaments à travers son programme de recherche et développement (70). D'autres ont appliqué avec succès la technologie BacMam pour le criblage de cibles médicamenteuses préférées telles que G-protein83). Néanmoins, la technologie promet un système de production efficace qui pourrait réduire le temps et les coûts dans le développement des produits biologiques. En raison de la concurrence mondiale et la hausse des coûts dans la bioproduction en utilisant des cellules de mammifères cultivées, certaines entreprises biopharmaceutiques mettent en œuvre des technologies à usage unique pour les petites et la production à moyenne échelle. L'utilisation de sacs jetables pour le stockage des médias, le développement de procédés, inoculum de semences, et les navires de bioréacteurs réels semble être une tendance solide. Un avantage majeur de bioréacteurs jetables plus de ceux en acier inoxydable viennent en plus rapides temps de demi-tour (sans stérilisation à la vapeur ou le nettoyage nécessaire), ce qui diminue considérablement les délais globaux et la complexité opérationnelle. Singh et al. introduit le premier système de culture à usage unique largement acceptée en 1999: bioréacteurs WAVE (84). Monté sur une plate-forme à bascule, les sacs peuvent presterilzed maintenir une densité cellulaire> 10 millions de cellules / ml dans la production de protéines recombinantes. Sans contrôle de l'oxygène dissous (DO) ou le pH, ce système application principale est en préparation d'inoculums de semences pour bioréacteurs grande, en acier inoxydable, cuve agitée. bioréacteurs Wave-mouvement sont également préférés dans la production des matériaux en vrac avec des transfections transitoires à grande échelle. systèmes-sac Brassé (par exemple, le HyClone SUB à usage unique bioréacteur de Thermo Fisher, le système BIOSTAT CultiBag STR de Sartorius Stedim Biotech, et le système XDR-DSTB de Xcellerex) voient une utilisation plus fréquente aujourd'hui, principalement en raison de vaste expérience déjà obtenu avec des bioréacteurs agités établies (85). Les bioréacteurs Xcellerex viennent à l'échelle de 2000 L et SUB HyClone peuvent accueillir 1000-L sacs. Prêt à l'usage, les sacs souples en polyéthylène sont fixés et mis en forme par un récipient en acier inoxydable à température contrôlée qui est ouverte au sommet. Un, lame en pente turbine intégrée avec un arbre coudé relié au sommet (ou une roue à entraînement magnétique sans aucune pénétration de l'arbre) est utilisé pour la culture d'agitation. Pour la mise en œuvre réussie de la technologie à usage unique comme un substitut viable pour l'acier inoxydable, des bioréacteurs traditionnels agités, il sera nécessaire de mettre en place une large gamme de données fiables à l'échelle. Des paramètres tels que le temps et la vitesse d'agitation de mélange en particulier doivent être déterminées pour chaque échelle de volume de travail. Réutilisables bioréacteurs en acier inoxydable sont caractérisés en termes de performances, les étapes d'optimisation, et la conception. Ils ont été la référence pendant de nombreuses décennies et sont soutenus par une grande quantité d'expérience de la connaissance et le contrôle de processus entre les opérateurs (86). Une étude a montré que pour les procédés de culture de cellules à haute densité en utilisant CHO ou NS0 cellules, produit à partir jetable à cuve agitée bioréacteurs produit de jetable bioréacteurs agités 1000-L échelle dans une configuration standard était comparable à celui produit à partir d'un 1000-L inoxy - dable bioréacteur en acier (87). Le train de semences, la récolte et le traitement en aval ont été effectuées en utilisant un équipement et des méthodes identiques, la seule différence était le type de bioréacteur impliqué. Des résultats encourageants des études comparables similaires donneraient l'impulsion nécessaire à l'incorporation à part entière de bioréacteurs jetables dans des installations biopharmaceutiques plus (62). La version sac agité a déjà été testé pour des applications potentielles dans les processus de perfusion continue (88). Accélérer le marché des produits Innovations dans la culture de mammifère des cellules, des vecteurs d'expression, et l'avènement des technologies automatisées pour l'isolement du clone ont contribué à réduire considérablement les délais de développement pour les produits biologiques. plates-formes de transfection transitoire à grande échelle sont encore aident dans le développement de produits accéléré en générant rapidement des matériaux e representativ. Chaque méthode ou outil de développement pose ses propres avantages et les limites. Ainsi, le choix de l'approche devient essentielle à la réussite d'un programme de développement. bioréacteurs jetables gagnent une énorme popularité parmi les nouveaux et établis fabricants de produits biologiques. La croissance et l'état de l'art dans l'industrie de la biotechnologie promet de réduire les flux de travail de développement en substituant pas de temps à forte intensité avec les rapides, réduisant ainsi les délais de développement de produits et processus. A propos de l'auteur Auteur Détails Auteur correspondant Vishal Agrawal, PhD, est un scientifique dans le groupe de bioproduction à Aragen Bioscience; 380 Woodview Avenue, Morgan Hill, CA 95037; 1-408-779-1700, fax 1-408-779-1711; vagrawal @ aragenbio. vishal_agrawal_iitd@yahoo. co. in. Manjot Bal, PhD, est un scientifique à l'Université du Texas Southwestern Centres Médicaux département de neurosciences à Dallas, TX. LES RÉFÉRENCES 1.) Durocher, Y, et M. Butler. 2009. Systèmes d'expression pour thérapeutique glycoprotéine production. Curr. Opin Biotechnol 20: 700-707. 2.) Birch, JR, et Y. Onakunle. 2005. biopharmaceutiques Protéines: opportunités et défis. Meth. Mol Biol 308: 1-16. 3.) Baldi, L. 2007. Recombinant Protein Production Par grande échelle transitoire expression génique dans les cellules de mammifères: état de l'art et perspectives futures. Biotechnol Lett 29: 677-684. 4.) Chu, L, et DK. Robinson. 2001. Choix industriels pour la production de protéines à grande échelle Par culture cellulaire. Curr. Opin Biotechnol 12: 180-187. 5.) Pham, PL, A Kamen, et Y. Durocher. 2006. grande échelle Transfection de cellules de mammifères pour la production rapide de protéine recombinante. Mol Biotechnol 34: 225-237. 6.) Dingermann, T. Les protéines recombinantes thérapeutiques 2008.: Plates-formes de production et défis. Biotechnol. J 3: 90-97. 7.) Hacker, DL, M De Jesus et FM. Wurm. 2009. 25 ans de protéines recombinantes du réacteur-Grown Cellules: Où allons-nous à partir d'ici. Biotechnol Adv 27: 1023-1027. 8.) Wurm, FM. 2004. Production de protéines thérapeutiques recombinantes dans des cellules de mammifères cultivées. Nat Biotechnol 22: 1393 à 1398. 9.) Birch, JR, et AJ. Racher. 2006. Production d'anticorps. Adv. Drug Livr Rev 58: 671-685. 10.) Jerums, M et X. Yang. 2005. Optimisation de la culture cellulaire des médias. Bioprocédés Int 3: S38-S44. 11.) Whitford, W. 2003. NS0 Culture et applications sans sérum. Bioprocédés Int 1: 36-47. 12.) Decaria, P, A Smith et W. Whitford. 2009. De nombreuses considérations dans le choix Bioproduction Culture Media. Bioprocédés Int 7: 44-51. 13.) Bibila, TA, et DK. Robinson. 1995. À la poursuite du processus de Fed-Batch optimale pour la production d'anticorps monoclonaux. Biotechnol Prog 11: 1-13. 14.) Cohen, SN. 1973. Construction de Biologiquement fonctionnelle bactérienne Plasmides in vitro. Proc. Natl. Acad. Sei USA 70: 3240-3244. 15.) Bendig, MM. 1988. La production de protéines étrangères dans les cellules de mammifères. Genêt Eng: 91-127. 16.) Stark, GR et GM. Wahl. 1984. Gene Amplification Ann. Rev Biochem 53: 447-491. 17.) Schimke, TA. 1984. Gene Amplification en Cultured cellules animales. Cellule 37: 705-713. 18.) Kaufman, RJ. 1990. La sélection et co-amplification de gènes hétérologues dans des cellules mammaliennes. Meth Enzymol 185: 537-566. 19.) Kaufman, RJ. 1986. Expression, purification et caractérisation de la gamma-carboxylée recombinante du facteur IX synthétisé dans les cellules ovariennes de hamster chinois. J. Biolog Chem 261: 9622-9628. 20.) Simonsen, CC et AD. Levinson. 1983. Isolement et expression d'une souris dihydrofolate réductase ARNC Altered. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 2495 à 2499. 21.) Omasa, T. 2002. Gene Amplification et son application en ingénierie cellulaire et tissulaire. J. Biosci Bioeng 94: 600-605. 22.) Rath, H, T Tlsty et RT. Schimke. 1984. Rapid Emergence de la Résistance méthotrexate dans les cellules cultivées de souris. Cancer Res 44: 3303 à 3306. 23.) Jones, SD, FJ Castillo, et HL. Levine. 2007. Les progrès réalisés dans le développement de la thérapeutique des anticorps monoclonaux. BioPharm Int 20: 96-114. 24.) Westwood, AD, DA Rowe, et HR. Clarke. 2010. Amélioration de rendement de protéine recombinante L'utilisation d'un Codon Deoptimized DHFR Marqueur sélectionnable dans une expression de CHEF1 plasmide. Biotechnol Prog 26: 1558 à 1566. 25.) Kingston, RE. Amplification Utilisation de CHO vecteurs d'expression cellulaire. 26.) Cockett, MI, CR Bebbington, et GT. Yarranton. 1990. haut niveau d'expression de l'inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases dans des cellules ovariennes de hamster chinois Utilisation de la glutamine synthétase amplification génique. Biotechnol 8: 662-667. 27.) Barnes, LM, CM Bentley et AJ. Dickson. 2000. Les progrès dans des cellules animales recombinantes Protein Production: système d'expression GS-NS0. Cytotechnol 32: 109-123. 29.) Jun, SC. 2006. Limitations au développement des cellules productrices d'anticorps humanisé ovariennes de hamster chinois Utilisation glutamine synthétase-Mediated Amplification génique. Biotechnol Prog 22: 770-780. 30.) Kwaks, TH, et AP. Otte. 2006. Employant épigénétique pour augmenter l'expression de protéines thérapeutiques dans les cellules de mammifères. Trends Biotechnol 24: 137-142. 31.) Girod, PA. 2007. Genome Wide Prédiction de la matrice des régions de fixation qui augmentent l'expression génique dans les cellules de mammifères. Nat Meth 4: 747-753. 32.) Kwaks, TH. 2005. Le ciblage d'un Histone Acetyltransferase de domaine à un promoteur améliore les niveaux d'expression de protéines dans les cellules de mammifères. J Biotechnol 115: 35-46. 33.) Williams, S. 2005. CpG-Island Fragments du HNRPA2B1 / CBX3 Genomic Locus plus Silencing et améliorer l'expression transgénique de la hCMV Promoteur / Enhancer dans les cellules de mammifères. BMC Biotechnol 05h17. 34.) Oumard, A. 2006. Méthode recommandée pour Chromosome Exploitation: CREM-Based Systems Cassette Exchange dans des cellules animales en biotechnologie. Cytotechnol 50: 93-108. 35.) Yarranton, GT. 1990. Mammifères protéines recombinantes: vecteurs et systèmes d'expression. Curr. Opin Biotechnol 1: 133-140. 36.) Wirth, M. 1988. Isolement de surproduisant recombinantes cellule mammalienne Lines par une procédure de sélection rapide et simple. Gene 73: 419-426. 37.) Kito, M. 2002. Construction d'ingénierie CHO Souches pour High Level-production de protéines recombinantes. Appl. Microbiol Biotechnol 60: 442-448. 38.) Huang, Y. 2007. Un système efficace et ciblée d'intégration génique pour haut niveau d'anticorps Expression. J. Immunol Meth 322: 28-39. 39.) Cacciatore, JJ, LA Chasin, et EF. Leonard. 2010. Gene Amplification et Vector Engineering pour atteindre les rapides et de haut niveau de protéine thérapeutique production Utilisation du système de sélection de cellules Dhfr-Based CHO. Biotechnol Adv 28: 673-681. 40.) Wirth, D. 2007. Road to Precision: recombinase-Based Targeting Technologies d'ingénierie des génomes. Curr. Opin Biotechnol 18: 411-419. 41.) Zhou, H. 2007. Développement de site spécifique Système d'intégration à haut niveau d'expression des protéines recombinantes dans des cellules CHO. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 23: 756-762. 42.) Kaufman, WL. 2008. Homogénéité et Persistance de l'expression transgénique Par Omission antibiotique Sélection en isolement cellulaire de ligne. Nucl Acids Res 36: e111. 43.) Zhou, H. 2010. La génération de lignées cellulaires stables Par l'intégration du site spécifique de transgènes dans Chinese Hamster Ovary Souches utilisant un système FLP-FRT. J Biotechnol 147: 122-129. 44.) Browne, SM, et M. Al-Rubeai. 2007. Méthodes de sélection des haut-production de lignées cellulaires de mammifères. Trends Biotechnol 25: 425-432. 45.) Carroll, S et M. Al-Rubeai. 2004. La sélection des lignes à grande cellule productrice par cytométrie en flux et Tri cellulaire. Expert Opin. Biol Ther 4: 1821-1829. 46.) Brezinsky, SC. Prot. Prot. Prot.
No comments:
Post a Comment